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运用近红外光谱建立延胡索中5种生物碱成分同步测定的定量模型

归档日期:07-02       文本归类:秦艽      文章编辑:爱尚语录

  [摘要]该文建立了同步测定延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱成分的近红外光谱定量模型。首先采用高效液相色谱结合紫外检测法测定延胡索中上述5种成分的化学值,然后采用傅里叶变换近红外光谱技术并结合偏最小二乘法(PLS) 建立、优化模型,采用校正模型的相关系数(r) 、校正均方根误差(RMSEC)、内部交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测模型的相关系数(r)和预测均方根误差(RMSEP)对校正模型进行评价。所建立的定量校正模型中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素的r分别为0941 0,0972 7,0964 3, 0978 1,0979 9; RMSEC分别为0006 7,0003 5,0005 9,0002 8,0005 9; RMSECV 分别为0015,0011,0020,0010,0022。预测模型中上述5种成分的相关系数r分别为0916 6, 0942 9,0943 6,0916 7,0914 5; RMSEP 分别为0009,0006 6,0007 5,0006 9,0011。该研究所建立的近红外定量模型稳定性较好,预测结果较准确,可望用于延胡索药材中5种主要生物碱成分的同步快速测定。[关键词]近红外光谱测定法;偏最小二乘法;无损测定;延胡索;生物碱成分[Abstract]This paper established a nearinfrared spectroscopy quantitative model for simultaneous quantitative analysis of coptisine hydrochloride, dehydrocorydaline, tetrahydropalmatine, corydaline and glaucine in Corydalis Rhizoma Firstly, the chemical values of the five components in Corydalis Rhizoma were determined by the reversedphase high performance liquid chromatography(RPHPLC) with UV detection.Then, the quantitative calibration model was established and optimized by fourier transformation nearinfrared spectroscopy(NIRS) combined with partial least square(PLS) regression The calibration model was evaluated by correlation coefficient(r), the rootmeansquare error of calibration(RMSEC) and the root mean square of crossvalidation(RMSECV) of the calibration model, as well as the correlation coefficient(r) and the root mean square of prediction(RMSEP) of prediction model For the quantitative calibration model, the r, RMSEC and RMSECV of coptisine hydrochloride, dehydrocorydaline, tetrahydropalmatine, corydaline and glaucine were 0941 0,0972 7, 0964 3, 0978 1, 0979 9; 0006 7, 0003 5, 0005 9, 0002 8, 0005 9; and 0015, 0011, 0020,0010 and 0022, respectively For the prediction model, the r and RMSEP of the five components were 0916 6, 0942 9, 0943 6, 0916 7, 0914 5; and 0009, 0006 6, 0007 5, 0006 9 and 0011, respectively The established nearinfrared spectroscopy quantitative model is relatively stable, accurate and reliable for the simultaneous quantitative analysis of the five alkaloids, and is expected to be used for the rapid determination of the five components in crude drug of Corydalis Rhizoma[Key words]nearinfrared spectrometry(NIRS); partial least squares(PLS); nondestructive analysis; Corydalis Rhizoma; alkaloids延胡索系罂粟科紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuo WT Wang 的干燥块茎,具有活血、行气、止痛作用,用于治疗胸胁、脘腹疼痛,胸痹心痛,经闭痛经,产后瘀阻,跌扑肿痛[1]。生物碱类成分,包括原小檗碱型和阿朴菲型两大类,既是延胡索的特征性成分,又是其主要活性成分。迄今为止已从延胡索中分离鉴定了46种生物碱类化合物,药理实验证明该类成分具有明确的镇痛、镇静、降压和抗心律失常等活性[2]。延胡索的质量控制主要是围绕其中的生物碱类成分展开的,其中针对延胡索乙素的研究最多。2010年版《中国药典》规定,延胡索药材中延胡素乙素的含量不得低于5/1万[1]。早期有关延胡索的质量控制多以延胡索乙素和/或紫堇碱和/或原阿片碱为检测指标,较少关注其他生物碱类成分。近年来,关于延胡索中多个生物碱类成分同步测定的报道日益增多 [35],研究结果为提高延胡索药材及相关制剂的质量控制水平奠定了基础。目前,延胡索中生物碱类成分质量控制采用的分析方法主要包括HPLCDAD [6],HPLCMSn[79]和GCMS[10]等。但是,这些分析方法都需要破坏样品,而且分析过程均包括对样品预处理、提取、稀释、检测分析等复杂步骤,耗时耗力。以新版药典中延胡索项下的含量测定为例,测定一个样品至少需要3 h,包括样品制备25 h,分析用时05 h,且需要耗费提取、分析用溶剂、色谱柱等。延胡索为常用大宗中药材品种,年需求量约5 000 t[11],按照现在药材从田间到临床至少需要经过产地加工,炮制,入库,投料,成品检验等多个环节的程序,每批延胡索药材要经历至少5次指标成分的检测才能到临床应用,这需要耗费大量的人力、物力和财力。若能开发一种简便快捷的检测方法,则会大大降低检测成本,提高检测效率。NIRS 分析技术是近年来发展起来并逐渐走向成熟的一种绿色分析技术,具有快速、无损、操作简便等优点。NIRS主要反映CH, OH, NH 等含氢基团的倍频及合频吸收,复杂组分含有大量的含氢基团,这是NIRS 进行分析研究的物质基础。NIRS 已经广泛应用于农产品、制药、烟草和石化等领域[12],在中药分析领域,主要应用于药材和中成药的鉴别[13]、定量分析[14]和中药制剂过程的质量控制[15]。延胡索产地不同,其所含生物碱成分可能会有较大差异,相应其品质会有所不同。本实验以延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种成分的含量为评价指标,采用TQ 90光谱软件将NIR光谱与对应的化学值相关联,建立延胡索中多种活性成分的同步定量校正模型,为寻求一种快速评价延胡索品质的新方法提供理论依据。傅立叶变换近红外光谱仪(Antaris Ⅱ,美国Thermo公司),配置固体漫反射检测器,石英样品杯、RESULT 3光谱采集软件、TQ90分析软件;Shimadzu LC20A高效液相色谱仪,包括LC20AT溶液传输单元,SIL20A自动进样器,SPDM20A二极管阵列检测器,CTO10AS 柱温箱,Labsolutions色谱工作站(日本岛津公司)。Millipore 超纯水器(美国Millipore 公司);KQ5200DB 型数控超声清洗器(昆山超声仪器有限公司);高速万能粉碎机,型号FW100,天津市泰斯特仪器有限公司。102批延胡索药材分别购自安徽亳州、湖南、成都、陕西、浙江、云南昆明等地,由中国中医科学院中药资源中心金艳鉴定为延胡索Cyanhusuo干燥块茎。对照品盐酸黄连碱(coptisine hydrochloride,批号Y024131109),脱氢紫堇碱(dehydrocorydaline, 批号T033131010),延胡索乙素(tetrahydropalmatine,批号y005131216)和延胡索甲素(corydaline,批号Y158130706)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司;海罂粟碱(glaucine,批号12784)购自Sigma 公司,所有对照品均供含量测定用。乙腈为色谱纯(Merck 公司),HPLC 所用水为Millipore 纯水机制备,其余试剂均为分析纯。取来自不同产地或购买地的延胡索样品100份,将样品进行粉碎,过40目筛,于80 ℃下干燥24 h,然后均称取5 g扫描光谱。采集光谱时,将称量好的延胡索粉末装入近红外光谱仪所附带的10 cm 石英样品杯内,等力压平,采用积分球漫反射方式采集100个样品的近红外光谱。以空气为参比,扫描范围12 000~4 000 cm-1,扫描次数64次,分辨率为16 cm-1。每个样品重复装样3次,取其平均光谱,见图1。2.2延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素化学值的HPLC测定2.2.1色谱条件Kromasil Eternity C18(46 mm× 250 mm,5 μm)色谱柱,流动相乙腈(A)01 mol・L-1醋酸铵溶液(每1 000 mL加冰醋酸05mL)(B)梯度洗脱(0 min, 20% A;50 min, 55% A;55 min,65% A;60 min, 65% A),流速10 mL・min-1,柱温25 ℃,检测波长为280 nm。在选定的色谱条件下,对样品进行含量测定,将测定值作为建模所需的参考值。对照品和样品的HPLC图,见图2。2.2.2对照品溶液的制备精密称取盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素对照品各适量,置棕色量瓶中,用色谱甲醇溶解并稀释至刻度,制得质量浓度分别为05, 02, 20, 03,A混合对照品; B延胡索药材;1 盐酸黄连碱;2海罂粟碱;3 脱氢紫堇碱;4 延胡索乙素;5 延胡索甲素。02 g・L-1的混合对照品储备液,备用。分别精密吸取上述混合对照品储备液20, 50, 100, 150, 200, 250 μL置1 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液1#~5#,备用。2.2.3供试品溶液的制备取本品粉末(过3号筛)约1 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入浓氨试液甲醇(1∶20)混合溶液20 mL,称定质量,加热回流1 h,放冷,再称定质量,用浓氨试液甲醇(1∶20)混合溶液补足减失的质量,摇匀,滤过,作为供试品溶液。2.3.1线性关系考察分别精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液(1#~5#)10 μL,注入高效液相色谱仪测定。以测得的响应信号(峰面积)和被测物的进样量(g),进行线性回归,得到各成分的回归方程及线个延胡索生物碱类成分的对照品在如下范围内成良好的线精密度试验取同一份延胡索供试品溶液(按223项下制备),连续进样6次,测定盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱的峰面积的RSD分别为051%,031%, 011%,019%,12%,表明仪器的精密度良好。2.3.3稳定性试验取同一份延胡索供试品溶液(按223项下制备),分别于样品制备后的0,1,2,4,6,8,24 h进样,测定峰面积,计算RSD。结果延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱成分的峰面积的RSD分别为12%,091%,021%,034%,13%,表明24 h内,供试品溶液的稳定性良好。2.3.4重复性试验取延胡索样品6份,按223方法制备供试品溶液,并经221项下方法测定。测得样品中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素的平均质量分数依次为013%,0040%,026%,0060%和0090%, RSD分别为35%,22%,23%,26%,17%。结果表明本方法重复性良好。2.3.5加样回收率试验取已知含量的延胡索药材粉末约05 g,精密称定,平行6份,分别按样品含量对照品(1∶1)大致比例加入5种延胡索生物碱的混合对照品溶液20 mL,按223项下方法制备供试品溶液,测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱成分的平均加样回收率分别为1008%, 1008%, 9862%, 1001%, 9916%, RSD分别为19%, 30%, 19%, 25%,18%,表明该方法的准确度良好。用对照品溶液绘制的标准曲线和样品溶液实测值计算出样品中各成分的化学值。然后用仪器附带的TQ 90光谱软件将近红外光谱图与化学值关联建模,并对模型进行优化和评价。采用漫反射原理进行建模,并采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)进行建模数据运算。将102个样品按照含量数值从大到小排列后,选取其中80个为校正集,22个为预测集(验证集),并确保预测集含量范围被校正集整体覆盖。不同集合内盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱含量具体分布情况, 见表2。实验中采集的光谱信号除包含与样品组成有关的信息外,同时也包含有高频噪音、基线漂移、光散射、样品的状态、杂散光及仪器响应等干扰信息。因此,在建立校正分析模型前,对原始光谱进行预处理可消除各种噪声和干扰,提高模型的精度和稳定性。常用的光谱预处理方法主要有平滑、多元散射校正(MSC) 、矢量归一化(VN) 、一阶导数、标准正态变量变换(SNV) 等。本实验以RMSECV、RMSEP和r为评价标准对几种预处理方法进行了比较,一个性能好的模型应具有较高的r,较低的RMSECV和RMSEP值,比较结果见表3。由表3可知,采用二阶导数法处理数据时5种生物碱成分的r为平均最高,而RMSECV 和RMSEP值为平均最低,因此选用二阶导数法为光谱数据预处理方法。采用偏最小二乘法(PLS)选择波段。PLS法是将全光谱等分为一定数量的子区间,采用子区间分别建立PLS 模型,通过交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测均方根误差(RMSEP)两个指标对子区间进行评价。RMSEP远大于RMSECV,说明建模样品代表性差,RMSEP远小于RMSECV,说明验证样品代表性差。本文采用PLS法将全光谱划分为5段,选择RMSECV值低于全光谱的子区间单独或组合进行建模,以RMSECV,RMSEP和r为评价标准,见表4。从表4可以看出,建模波段为7 504~3 956 cm-1时,5个成分的r值最大, RMSECV 和RMSEP 均较小且比较接近,因此选择建模波段为7 504~3 956 cm-1。选择不同的主成分数将显著影响PLS 定量分析模型的预测结果。因为在校正集数目一定的情况下,主成分过少,会出现“欠拟合”现象;而主成分数过多则会降低信噪比,出现“过拟合”现象,二者皆会导致模型的预测能力下降[16]。故本实验采取内部交叉验证方法,考察主成分数对RMSECV 的影响。本实验RMSECV最小值为盐酸黄连碱0015,海罂粟碱0011,脱氢紫堇碱0020,延胡索乙素0010,延胡索甲素 0022,对应的最佳主因子数分别为6,7,7,7,6。由上述结果可知,本研究建立的最优PLS定量分析模型为: 首先对NIR 光谱进行二阶导数预处理,再在波段为7 504~3 956 cm-1的条件下,构建校正模型,见图3。校正模型中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素的相关系数分别为0941 0,0972 7,0964 3, 0978 1和0979 9,校正均方根误差(RMSEC)分别为0006 7,0003 5,0005 9,0002 8,0005 9,内部交叉验证均方根误差(RMSECV)分别为0015,0011,0020,0010,0022。为了检验校正模型的可靠性与稳定性,除了采用模型自身的参数进行内部交叉验证以外,还需采用预测集样品对模型进行外部检验。本文对未参与建模的22个预测集样品进行了预测,见表5,6,并将预测值与各组分的化学值进行比较绘制了相关关系图,见图3。其中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素的RMSEP分别依次为0009,0006 6,0007 5, 0006 85,0011; r 分别依次为 0916 6, 0942 9,0943 6,0916 7,0914 5。本该文所建立的NIRS 定量模型能同时测定延胡索中5个生物碱成分的含量,样品制备分析极其简单,大大节省了检测时间(一个样品的测定仅1 min而已 )和人力,提高了分析效率。而且,22批预测集样品的检验结果显示,延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱成分含量预测值与化学值(HPLC值)之间的相关系数分别为0916 6, 0942 9,0943 6,0916 7,0914 5;80%(85/110)预测值与化学值的相对偏差在±10%,只有20%(25/110)预测值与化学值的相对偏差介于±10%~±20%,结果表明在一定误差范围内NIRS 方法较传统HPLC 检测法具有省时,省力,节约成本的优势。相对偏差大的数据主要集中在盐酸黄连碱(50%预测值与化学值的相对偏差绝对值大于10%)上,分析所有数据后发现:盐酸黄连碱的含量偏低而且分布分散(0022 9%~0116%),其相对偏差较大(22个预测值中的11个预测值与化学值的相对偏差的绝对值大于10%),相关系数r (0916 6)不高;而与之相对的是脱氢紫堇碱含量较高且分布集中(0122%~0214%),其相对偏差较小(22个预测值中只有1个值的相对偏差的绝对值大于10%)且相关系数r (0943 6)也较高,由此说明:① 对校正模型进行考察时,既要考察预测集样品的预测值与化学值的相关系数,还需考察预测值与化学值的相对偏差,只有同时满足相关系数高且相对偏差小这2个条件,才说明校正模型建立成功;② 样品含量越高,预测结果的相关性越好,预测结果的准确性越高。 因此,应不断对模型进行修正,直到预测集样品的预测值与化学值的相关系数较高(如r>

  本该文所建立的NIRS 定量模型能同时测定延胡索中5个生物碱成分的含量,样品制备分析极其简单,大大节省了检测时间(一个样品的测定仅1 min而已 )和人力,提高了分析效率。而且,22批预测集样品的检验结果显示,延胡索中盐酸黄连碱、海罂粟碱、脱氢紫堇碱、延胡索乙素和延胡索甲素5种生物碱成分含量预测值与化学值(HPLC值)之间的相关系数分别为0916 6, 0942 9,0943 6,0916 7,0914 5;80%(85/110)预测值与化学值的相对偏差在±10%,只有20%(25/110)预测值与化学值的相对偏差介于±10%~±20%,结果表明在一定误差范围内NIRS 方法较传统HPLC 检测法具有省时,省力,节约成本的优势。相对偏差大的数据主要集中在盐酸黄连碱(50%预测值与化学值的相对偏差绝对值大于10%)上,分析所有数据后发现:盐酸黄连碱的含量偏低而且分布分散(0022 9%~0116%),其相对偏差较大(22个预测值中的11个预测值与化学值的相对偏差的绝对值大于10%),相关系数r (0916 6)不高;而与之相对的是脱氢紫堇碱含量较高且分布集中(0122%~0214%),其相对偏差较小(22个预测值中只有1个值的相对偏差的绝对值大于10%)且相关系数r (0943 6)也较高,由此说明:① 对校正模型进行考察时,既要考察预测集样品的预测值与化学值的相关系数,还需考察预测值与化学值的相对偏差,只有同时满足相关系数高且相对偏差小这2个条件,才说明校正模型建立成功;② 样品含量越高,预测结果的相关性越好,预测结果的准确性越高。 因此,应不断对模型进行修正,直到预测集样品的预测值与化学值的相关系数较高(如r±5%)时才算真正建立好模型。依据本研究结果,今后工作中,可将预测含量与规定值相对偏差小于±20%(如2010年版《中国药典》规定延胡索药材中延胡索乙素的质量分数不得低于005%,那么预测值为004%~006%的样品与规定值005%的相对偏差则小于±20%) 的样品再做hplc 检测以求得真值确保其质量,而预测含量与规定值相对偏差大于±20%的样品则可直接用nirs定量模型评价其质量优劣。试验中比较了5个成分同步建模的NIRS定量模型和5个成分分别建模的NIRS定量模型的优劣。因为2010年版药典中仅规定了延胡索药材中延胡索乙素的含量不得低于005%,而对其他成分的含量没有规定,因此以延胡索乙素为例进行说明。5个成分同步建模时,延胡索乙素预测集样品预测值与化学值的相关系数r为0916 7,相对偏差的绝对值介于080%~129%,4个预测值的相对偏差的绝对值大于10%;而当延胡索乙素单独建模时,预测集样品预测值与化学值的相关系数r为0920 4,相对偏差的绝对值介于009%~103%,同样4个预测值的相对偏差的绝对值大于10%。由此可见,延胡索乙素单独建模优势并不明显;因此,考虑到本研究提高检测效率以节省人力、物力和财力的研究初衷,笔者优选5个成分同步建模的NIRS 定量模型。[2]杨鑫宝,杨秀伟,刘建勋 延胡索物质基础研究[J] 中国中药杂志,2014,39(1):20[3]Cheng X Y, Shi Y, Zhen S L, et al HPLCMS analysis of ethanol extract of Corydalis yanhusuo and simultaneous determination of eight protoberberine quaternary alkaloids by HPLCDAD[J] J Chromatogr Sci, 2010, 48(6):441[4]Ding B Zhou T T, Fan G R, et al Qualitative and quantitative determination of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo WTWang by LCMS/MS and LCDAD[J] J Pharm Biomed Anal, 2007, 45(2):219[5]Li K T, Xing D M, Jin W, et al Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of the medicinal extract of Corydalis yanhusuo by HPLCUV and HPLCMS methods[J] Asian J Chem, 2011, 23(2):723[6]Wu H W, Waldbauer K, Tang L Y, et al Influence of vinegar and wine processing on the alkaloid content and composition of the traditional Chinese medicine Corydalis Rhizoma(Yanhusuo) [J] Molecules, 2014,19: 11487[7]Zhang Y C, Xu H Y, Chen X M et al Simultaneous quantification of 17 constituents from Yuanhu Zhitong tablet using rapid resolution liquid chromatography coupled with a triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometry[J] J Pharm Biomed Anal, 2011, 56(3): 497[8]Tao Y, Xu H Y, Wang S S, et al Identification of the absorbed constituents after oral administration of Yuanhu Zhitong prescription extract and its pharmacokinetic study by rapid resolution liquid chromatography/quadrupole timeoff light[J] J Chromatogr B, 2013, 935:1[9]Zhang J, Jin Y, Dong J, et al Systematic screening and characterization of tertiary and quaternary alkaloids from Corydalis yanhusuo WT Wang using ultraperformance liquid chromatographyquadrupoletimeofflight mass spectrometry[J] Talanta, 2009,78(2):513[10]Guo Z F, Su H D, Li Y L Alkaloids in processed Rhizoma Corydalis and crude Rhizoma Corydalis analyzed by GC/MS[J] J Anal Methods Chem, 2014, 1[11]周晓龙 延胡索产销分析[J] 中国现代中药, 2013,15(4):340[12]Nicola B M, Beullens K, Bobelyn E, et al Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of NIR spectroscopy: a review[J] Postharvest Biol Technol, 2007,46(2): 99[13]Li W L, Xing L H, Cai Y, et al Classification and quantification analysis of Radix Scutellariae from different origins with near infrared diffuse reflection spectroscopy[J] Vib Spectrosc, 2011, 55(1):58[14]战皓,柳梦婷, 方婧,等. 近红外分析技术在中药鉴定和含量测定中的应用研究成果[J]. 中国实验方剂学杂志,2015,21(12):231.[15]郑爽,杨海龙,臧恒昌 近红外光谱分析技术在中药生产过程质量控制领域的应用[J] 食品与药品, 2013,15(2): 135[16]陆婉珍现代近红外光谱分析技术[M]2 版北京: 中国石化出版社,2007: 37

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